Eficacia de la Melatonina.

Estudioas experimentales de Sepsis

A nivel experimental, hemos evaluado la eficacia de la melatonina en la sepsis en los siguientes modelos experimentales:

  1. Sepsis inducida por la administración de lipopolisacáridos bacterianos (LPS) en ratas.
  2. Sepsis inducida por la administración de lipopolisacáridos bacterianos (LPS) en ratones.
  3. Sepsis inducida por punción cecal en ratones.
  4. Sepsis inducida por LPS en ratas y punción cecal en ratones viejos.
  5. Sepsis inducida punción cecal en ratones transgénicos knockout para la iNOS y nNOS.

En estos modelos experimentales se han analizado los siguientes mecanismos:

  1. Vía de activación de la inmunidad innata dependiente de Nf-kB
  2. Vía de activación de la inmunidad innata dependiente del inflamasoma NLRP3
  3. Vía de Bmal1/RORα/sirtuína 1
  4. Función mitocondrial y producción de ATP
  5. Función hepática, renal, y metabólica
  6. Sistemas de defensa antioxidante
  7. Vida media y supervivencia

Resumen de Resultados.

  • La melatonina inhibe la activación de la vía de Nf-kB de la inmunidad innata, inhibiendo así al expresión y actividad de todas las enzimas proinflamatorias dependientes de aquella (iNOS, COX-2, etc.).
  • La melatonina, por el mismo motivo, inhibe la expresión de las citoquinas proinflamatorias dependientes de Nf-kB.
  • La melatonina inhibe la vía complementaria de la inmunidad innata, el inflamasoma NLRP3, que es requerida para la completa activación de dicha inmunidad en la sepsis.
  • La melatonina recupera la función mitocondrial y producción de ATP, y contrarresta el estrés oxidativo y escape de radicales libres al citosol, que es uno de los mecanismos de activación del inflamasoma NLRP3.
  • Esta producción de ATP se inhibe principalmente pro la activación de la iNOS, mientras que la nNOS no participa en erl daño mitocondrial (ni citosólico) en la sepsis (Figura 1).
  • La melatonina frena de la misma manera, pero de manera más potente, la activación de Nf-kB y NLRP3 en los animales viejos, en los cuales la agresividad de estas respuestas es mucho mayor.
  • Hemos identificado, además de las nuevas vías de la inmunidad innata dependientes de NLRP3 en la sepsis, las dianas moleculares de la melatonina que explican su eficacia antiséptica.
  • Estas dianas terapéuticas de la melatonina son dependientes del receptor nuclear RORα, y se producen por activación de Bmal1/Sirtuína1, que deacetila Nf-kB frenando su activación.
  • La otra diana terapéutica de interés es la mitocondria, donde la melatonina reduce el escape de electrones y escape de protones, reduce la generación de radicales libres, aumenta la actividad de los complejos respiratorios y la produción de ATP. De esta manera, cierra el poro de transición, ya no salen radicales libres al citosol (entre otras cosas porque ya se han reducido), y se inactiva el inflamasoma NLRP3.
  • Estos efectos beneficiosos de la melatonina ocurren en todos los tejidos analizados y que se afectan de manera más agresiva en la sepsis (hígado, pulmón, corazón, músculo esquelético, diafragma).
  • Como consecuencia, la melatonina aumenta significativamente la vida media (>31%)  y supervivencia (>64%) de los animales sépticos (Figura 2).
  • Los estudios in vivo demuestran que los efectos de la melatonina no ocurren solamente a nivel bioquímico, si no también sistémico y fenotípico (Figura 3).
  • Los estudios farmacocinéticos y de biodisponibilidad de la melatonina en el organismo nos han permitido calcular, a partir de la dosis equivalente humana, de las dosis efectivas para el tratamiento de la sepsis humana.

Detalle de los Resultados Principales.

1. Vía de activación de la inmunidad innata dependiente de Nf-kB. Primer estudio que se publica del efecto de la melatonina en la sepsis.

El estudio inicial los realizamos en 1999 en un modelo de sepsis inducida por administración de LPS a ratas (1).

Los resultados indicaron que la administración de LPS (10 mg/kg peso, serotipo 0127:B8, i.p.) provocó un cuadro de shock séptico y fallo multiorgánico a las 6 horas, caracterizado por un aumento ed la expresión y actividad de la iNOS, aumento de óxido nítrico (NO), y fallo multiorgánico, incluyendo fallo hepático (con un marcado aumento de GOT, GPT, γGT, fosfatasa alcalina, y bilirrubina total y directa); fallo renal (aumento de creatinina, urea, y ácido úrico), y metabólico (descenso de glucosa, proteínas totales y albúmina, y aumento de colesterol y triglicéridos).

la administración de melatonina (10 a 60 mg/kg, i.p.) redujo, de forma dosis-dependiente, la expresión y actividad de la iNOS y formación de óxido nítrico (NO) en hígado y pulmón de dichos animales. Estos cambios se acompañaron de una total normalización de los marcadores bioquímicos medidos, recuperándose el animal del fallo multiorgánico y del shock séptico.

2. Vía de daño mitocondrial y efecto de la edad en ratas tratadas con LPS. Primer estudio que se publica de la activación de una iNOS en la mitocondria de ratas sépticas, y su recuperación por la melatonina.

Este estudio fue diseñado para evaluar el daño mitocondrial en ratas sépticas jóvenes (3 meses) y viejas (18 meses) tratadas con LPS según el mismo protocolo que en el punto anterior. El objetivo era ver si la edad influye en la respuesta a la sepsis, como sucede en la clínica (2).

Los resultados nos permitieron demostrar por primera vez que durante la sepsis se induce una iNOS en la mitocondria, que produce un aumento exagerado de NO dañando los complejos respiratorios. Este efecto fue mucho más significativo en las ratas viejas, ya que éstas mostraron una mayor inducción de la iNOS mitocondrial y, por tanto, más daño mitocondrial y mortalidad.

Al igual que en el caso anterior, la administración de melatonina previno la inducción de la iNOS mitocondrial, restauró la actividad mitocondrial, y previno el fallo titular y muerte.

3. Efecto de la edad en al respuesta a la sepsis en ratas tratadas con LPSy su recuperación por la melatonina. Primer estudio que avala y demuestra que la melatonina es más efectiva cuanto mayor es el proceso séptico, lo que ocurre fundamentalmente en animales viejos.

Con los datos anteriores, decidimos explorar con detalle qué ocurre en ratas viejas cuando se induce sepsis por LPS, a nivel de la expresión de INOS y del fallo multiorgánico. Lo que observamos es que, además de encontrar un efecto edad-dependiente para aumentar la expresión y actividad de la INOS en hígado y pulmón de las ratas, estos cambios se acompañaron de un daño hepático, renal y metabólico mucho más severo que en las ratas jóvenes (3).

Los resultados indicaron que los mecanismos de respuesta a la sepsis, en términos de inducción de iNOS y daño tisular que llevan al fallo multiorgánico, son mucho más agresivos con la edad, lo que explica la mayor mortalidad de la sepsis en personas mayores.

Como en casos anteriores, la administración de melatonina contrarrestó totalmente los cambios inducidos por la sepsis en los animales viejos, recuperándolos del fallo multiorgánico y shock séptico. Los resultados nos indicaron, además, que la efectividad de la melatonina fue mayor en los animales viejos que en los jóvenes, reforzando su extraordinario efecto antiséptico.

4. Evaluación del daño inducido por la sepsis en otros tejidos de gran importancia. Modelos de punción cecal en ratones y efectividad de la melatonina.

Una vez establecidas las bases del efecto antiséptico de la melatonina en los modelos de ratas inyectadas con LPS, se realizaron una serie de estudios conducentes a valorar el daño titular y mitocondrial en los diferentes tejidos de interés patogénico en la sepsis en otro modelo que es más parecido a la sepsis humana, como es la punción cecal. Entre los tejidos estudiados, además de hígado y pulmón, se incluyeron corazón, músculo esquelético y diafragma (4-6).

En todos los casos anteriores, existe un considerable daño mitocondrial, con reducción de la actividad de los complejos respiratorios, aumento del daño oxidativo, y reducción de la producción de ATP. Todo ello llevó al fallo multiorgánico en esos tejidos, y la muerte del animal.

Estos estudios se hicieron, además, en ratones kockout para iNOS y nNOS, para valorar la participación de cada isoforma de la NOS en la fisiopatología de la sepsis. Los resultados demostraron el papel fundamental de la iNOS y de su forma mitocondrial, i-mtNOS, en el fallo mitocondrial de la sepsis, sin que la nNOS tenga ningún papel prominente en la fisiopatología de la enfermedad.

La administración de melatonina, a dosis de 90-120 mg/kg ip., previno totalmente el desarrollo del fallo mitocondrial, aumentó la capacidad de producción de ATP y contrarrestó el daño oxidativo e inflamatorio, rescatando a los animales del shock séptico y fallo multiorgánico.

5. Evaluación de la supervivencia a la sepsis en el modelo de punción cecal en ratones tratados con melatonina.

Una vez conocidos los efectos beneficiosos de la melatonina frente a la sepsis, tanto en modelos de LPS como de punción cecal, el paso siguiente fue estudiar supervivencia (7).

Los resultados encontrados nos indican que el 50% de los ratones sin tratamiento mueren a las 26 horas de realizar la punción cecal, y la supervivencia máxima es de 33 horas, cuando todos los animales mueren. En el caso de los animales tratados con melatonina, a dosis de 90-120 mg/kg ip., el 50% de los ratones mueren a las 35 horas, mientras que aún a las 55 horas sigue un 25% de los ratones vivos.

Estos datos demuestran la gran eficacia antiséptica de la melatonina, consistente no sólo en contrarrestar los aspectos bioquímicos de la sepsis, si no también en mejorar el estado y supervivencia de los ratones.

Hay que destacar siempre que se trata de un estado de shock séptico y fallo multiorgánico, situación crítica en los pacientes, que es capaz de prevenir la melatonina y reducir significativamente la mortalidad.

La otra consideración importante a tener en cuenta es que, para valorar el efecto de la melatonina, los ratones nunca se trataron con ningún otro fármaco antiséptico, lo que potencia aún más la gran efectividad de la melatonina.

6. Evaluación de la bioenergética mitocondrial en el modelo de punción cecal en ratones tratados con melatonina.

El paso siguiente fue estudiar todos los mecanismos bioenergéticos que se alteran en la sepsis, para buscar las dianas de la melatonina (8, 9).

Para ello, se usó un equipo de respirometría de alta resolución (Oxygraph 2K), que permite identificar cualquier pequeño cambios en los mecanismos de respiración mitocondrial.
Los resultados nos permitieron identificar los fallos en los complejos mitocondriales y los lugares en los cuales la melatonina actúa para corregirlos, proporcionando de esta manera un conocimiento muy exacto de lo que ocurre en la mitocondria durante la sepsis, y dónde se origina el déficit de ATP.

Asimismo, esta metodología permitió identificar los sitios de acción de la melatonina dentro de los complejos respiratorios, proporcionando información terapéutica de enorme interés.

7. Identificación de nuevas vías moleculares (inflamasoma NLRP3) en la sepsis y del efecto de la melatonina en el modelo de punción cecal en ratones.

Recientemente, se publicó la activación del inflamasoma NLRP3 por los radicales libres generados durante el daño mitocondrial. Ya que este inflamasoma es necesario para activar la pro-IL-1β a IL-1β, que es la principal citoquina proinflamatoria, que además estimula por retroalimentación positiva a la vía de Nf-kB, planteamos que en la sepsis podría concurrir la activación de ambas vías, Nf-kB y NLRP3 (10).

Para analizar esta nueva situación, realizamos una serie de experimentos in vivo e in vitro en ratones controles y deficientes en RORα, un receptor nuclear de melatonina y relacionado con la activación de Nf-kB. Para ello, es estudió la vía completa de activación de Nf-kB desde el citosol al núcleo, la vía de activación del inflamasoma NLRP3, desde la disfunción mitocondrial y su ensamblaje en el citosol, hasta la activación de la caspasa 1 y subsiguiente maduración de IL-1β.

Los resultados demostraron, por primera vez, que la activación del inflamasoma NLRP3 es requerido para la completa respuesta de la inmunidad innata durante la sepsis, y explica la exagerada respuesta de esta inmunidad innata, así como el hecho de que los antiinflamatorios usados en la sepsis son poco efectivos, ya que van dirigidos hacia la vía de Nf-kB pero no afectan al inflamasoma NLRP3 ni al fallo mitocondrial, que es el causante de la activación de dicho inflamasoma.

Los resultados de este estudios también nos permitieron demostrar que la exacerbación de la inmunidad innata en la sepsis se debe a una alteración de los genes reloj, fundamentalmente Bmal1, debido a la inhibición de RORα y activación de Rev-Erbα. Esta situación da lugar a una inhibición de la sirtuína 1, lo que mantiene en constante actividad a Nf-kB en el núcleo y, por tanto, la activación de NLRP3 e IL-1β, cerrando el circuito de retroalimentación positiva de la inmunidad innata en la sepsis.

La administración de melatonina restaura la función normal de los genes reloj, aumentando Bmal1, aumentando RORα y frenando a Rev-Erbα, lo que lleva a un aumento de sirtuína 1, inhibición de Nf-kB y disminución de esta vía de la inmunidad. En paralelo, la melatonina recupera la función mitocondrial, reduce los radicales libres y la activación del inflamasoma NLRP3, frenando también esta otra vía de la inmunidad.

En resumen, la melatonina se comporta como un antiinflamatorio de primera línea, al frenar simultáneamente ambas vías de la inmunidad innata activadas durante la sepsis, Nf-kB y NLRP3. Además, demostramos que la melatonina requiere la presencia del receptor nuclear RORα para estos efectos.

La constatación de la eficacia antiséptica de la melatonina se realizó en experimentos in vivo, en ratones transgénicos Nf-kB-RE-luc, que contienen un gen de la luciferasa ligado al promotor de Nf-kB. Cuando Nf-kB se activa, el ratón expresa luciferasa y, en presencia de luciferina inyectada al mismo, emite luz que se puede detectar mediante un equipo Ivis Spectrum. De esta forma, observamos cómo los ratones inyectados con melatonina no emiten luz, demostrando que la respuesta inflamatoria tampoco se produce in vivo en los ratones sépticos.
Los resultados de este estudio proporcionan nuevas vías moleculares relacionadas con la respuesta de la inmunidad innata en la sepsis, y descubre nuevas dianas moleculares de la melatonina, así como demuestran realmente la alta eficacia antiséptica de la melatonina.

8. Amplificación de estas nuevas vías moleculares (inflamasoma NLRP3) en la sepsis en ratones viejos y caracterización del efecto de la melatonina en el modelo de punción cecal en ratones.

Con el fin de conocer si estas nuevas vías de la inmunidad innata también se sobreactivan con el envejecimiento, hicimos estudios similares en ratones de 18 meses de edad (11).

Los resultados nos demostraron una mayor activación de Nf-kB y del inflamasoma NLRP3 que, junto con el mayor daño mitocondrial, explican la mayor mortalidad en pacientes mayores.

Asimismo, pudimos identificar mejor las dosis de melatonina que son eficaces para contrarrestar totalmente ambas vías de la inmunidad innata y prevenir la sepsis en dichos ratones.
contrarrestar.

9. Cálculos de dosis

Uno de los aspectos principales de todos estos estudios es que las dosis de melatonina usadas en los distintos modelos experimentales, de 60-120 mg/kg, fueron totalmente eficaces para contrarrestar todos los cambios moleculares que se producen en la sepsis, tanto por administración de LPS como por punción cecal.

Esos datos nos indicaban unos efectos específicos de la melatonina, que hemos ido identificando en los experimentas anteriores, y que nos permiten identificar tres dianas terapéuticas principales:

1. Inhibición de la vía de Nf-kB
14. Inhibición de la vía del inflamasoma NLRP3
15. Recuperación de la bioenergética mitocondrial

El paso siguientes deducir qué dosis serían eficaces en la clínica humana.

Para ellos hicimos primero una serie de estudios para evaluar la farmacocinética de la melatonina en los distintos tejidos de la rata, así como su distribución intracelular, tras su administración exógena. Los estudios dosis-respuesta (12) indicaron unos mecanismos de saturación intracelularintracelular de la melatonina, de manera que a dosis superiores a 40 mg/kg ip, ya no entra más melatonina a sus lugares diana, núcleo y mitocondria.

Mediante la fórmula de dosis equivalente humana (13), y a partir de no sólo los experimentos de sepsis, si no muchos otros modelos animales (Parkinson, envejecimiento, Alzheimer), calculamos los rangos de dosis de melatonina que deben ser de utilidad en la clínica humana, y que han aplicado en el ensayo clínico en pacientes de sepsis realizado por INYMEL BIOMÉDICA, S.L. recientemente.

Bibliografía

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3. Escames, G., et al. (2006). Age-dependent lipopolysaccharide-induced iNOS expression and multiorgan failure in rats: effects of melatonin treatment. Expt Gerontol., 41: 1165-1173.

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